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ChIP实验步骤
2025年02月28日
ChIP实验步骤
实验原理：
通过甲醛交联固定蛋白质-DNA复合物，超声破碎染色质，利用特异性抗体富集目标蛋白结合的DNA片段，最终分析DNA序列或含量。
主要试剂与材料
37% 甲醛（交联用）
甘氨酸（终止交联）
细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂）
超声破碎仪（或超声探头）
特异性抗体（目标蛋白抗体及对照IgG）
Protein A/G磁珠（或琼脂糖珠）
DNA纯化试剂盒
其他：SDS裂解液、低盐/高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤液、TE缓冲液等。
实验流程
1. 细胞固定与交联
适用样本：贴壁细胞、悬浮细胞或组织。
步骤：
向培养基中加入甲醛至终浓度 1%，室温交联 10-15分钟（时间需优化，过长导致染色质难破碎）。
加入甘氨酸至终浓度 0.125M，室温孵育 5分钟 终止交联。
冰预冷PBS洗涤细胞2次，收集细胞（离心或刮�。�。
2. 染色质片段化
关键：超声将染色质打断至 200-1000 bp 片段（需预实验优化）。
步骤：
重悬细胞于含蛋白酶抑制剂的裂解液中，冰上裂解 10分钟。
超声处理（示例参数）：
功率：20-30% 最大功率（避免过热）
时间：10秒开/30秒关，循环 10-15次（根据仪器调整）
取少量超声后染色质，电泳验证片段大�。勘�：200-500 bp）。
3. 免疫沉淀（IP）
预清除（可�。�：
加入Protein A/G磁珠，4℃旋转孵育 1小时，减少非特异性结合。
抗体孵育：
分装染色质至各管，加入 特异性抗体（实验组）或 对照IgG（阴性对照）。
4℃旋转孵育 过夜（或根据抗体说明调整时间）。
捕获复合物：
加入Protein A/G磁珠，4℃旋转孵育 2-4小时。
4. 洗涤与洗脱
洗涤步骤（依次进行，保持低温）：
低盐缓冲液 → 高盐缓冲液 → LiCl缓冲液 → TE缓冲液，各洗1次。
洗脱DNA-蛋白复合物：
加入含1% SDS的洗脱缓冲液，65℃震荡孵育 15分钟，重复一次。
解交联：
加入5M NaCl至终浓度 0.2M，65℃孵育 4-6小时（或过夜）。
5. DNA纯化与检测
纯化DNA：
使用DNA纯化试剂盒（如酚-氯仿抽提或硅胶柱纯化）。
检测：
qPCR：定量目标DNA富集程度（需设计特异性引物）。
测序（ChIP-seq）：用于全基因组分析。
注意事项
抗体选择：需验证抗体ChIP级别特异性（避免假阳性）。
超声优化：过度超声破坏复合物，不足导致片段过大。
对照设置：
Input DNA（未IP的染色质，作为总DNA对照）。
IgG对照（排除非特异性结合）。
防止降解：全程使用蛋白酶抑制剂，操作快速且低温。
常见问题与解决
问题 可能原因 解决方案
信号弱或无信号 抗体效率低/超声过度 验证抗体活性，优化超声条件
高背景（假阳性） 非特异性结合或洗涤不彻底 增加洗涤次数，优化抗体浓度
DNA片段过大/过小 超声参数未优化 预实验调整超声功率和时间
Input DNA量低 细胞起始量不足或裂解不完全 增加细胞量，确保充分裂解
安全提示
甲醛、SDS等试剂具有毒性，需在通风橱中操作，佩戴手套、护目镜。
超声仪避免空载运行，防止探头损坏。
